图1. CRISPR位点结构图
CRISPR-Cas系统可分为Class I和Class II两大类（图2）[1]。
Class I：它们利用多种Cas蛋白形成影响复合物切割外源核酸的效应因子，包括Ⅰ-E型和Ⅲ型。
Class II：它们利用单个Cas蛋白进行靶向和核酸酶活性，包括Ⅱ型、V型和ⅤI型，其中II型使用Cas9蛋白，也是最常用的类型。
II型CRISPR/Cas9系统含有高GC原间隔相邻基序（PAM），主要由Cas9、tracrRNA（反式激活crRNA）和crRNA（crRNA的前体）组成。
图2. 天然存在的Cas蛋白和工程化的Cas蛋白
02
CRISPR-Cas9介导基因组编辑的基本机制
Cas9具有像HNH（His/Asn/His）和RuvC（重组UVC）样的DNA切割结构域。Ruv C结构域切割了ds DNA的相反链，HNH结构域切割了互补的crRNA链。
在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割，使DNA产生双链断裂(DSB)，经过细胞自主性的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)进行修复，对靶基因进行敲除、插入和突变修饰（图3）[2]。
图3. CRISPR-Cas9介导的基因组工程的机制
具体作用机制可分为以下三个阶段（图4）[2]：
1. 获得CRISPR的高度可变的间隔区：当被外源噬菌体或质粒侵入时，含有CRISPR的细菌和古菌获得插入间隔区的外源DNA片段；
2. CRIPSR基因座的表达：间隔区同源的外来核酸重新进入细菌，激活CRISPR阵列转录产生pre-crRNA，同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA也被转录出来，tracrRNA在转录后首先与Cas9蛋白结合，pre-crRNA和tracrRNA之间的互补碱基配对形成双链RNA，然后与Cas9结合形成复合物。
双链RNA与Cas9发生结合后，RNase III在初级过程中构建pre-crRNA，在二次加工Cas9 可减少多余的重复序列和间隔序列。在这两个过程之后，crRNA成熟并获得靶向DNA链的能力。
3. CRISPR/Cas系统活性的发挥（靶向干扰）:如果再次感染同源 DNA，细菌将启动CRISPR区域的转录。经过一系列加工和成熟过程以产生sgRNA，sgRNA引导Cas9剪切破坏同源间隔区域的DNA链导致DSB，细胞通过NHEJ或HR进行对靶基因修复。
图4. CRISPR-Cas9介导的DNA干扰细菌适应性免疫
将Cas9中切割域突变（如D10A和H840A突变），就会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性，但不影响其与DNA的结合能力，这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Cas9（dCas9）。
dCas9蛋白结合DNA后，通过CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi）来精确靶向几乎任何所需的基因组位点来激活或抑制靶基因，可以导致瞬时转录和表观遗传调节（图5）。
图5. dCas9蛋白激活或抑制靶基因
03
CRISPR-Cas9生物形式
为了实现预期的基因组修饰，CRISPR/Cas系统的功能单元最终必须存在于靶细胞的细胞核中。这可以通过递送不同的生物分子Cas9和gRNA格式来实现，包括质粒DNA（pDNA），RNA或Cas9核糖核蛋白（RNP）（图6）[3]。
图6. CRISPR-Cas9的三种生物形式
质粒DNA（pDNA）是递送CRISPR系统的理想方式，因为它不易降解，可以大量扩增，并且易于修饰。
进入细胞后，携带CRISPR/Cas9的质粒在NLS的帮助下进入细胞核，转录编码Cas9和sgRNA。这个过程非常繁琐，在mRNA上加载CRISPR/Cas9工具可能会大大简化这个过程。然而，mRNA容易降解，稳定性低。特别是，传递Cas9与效应蛋白协同功能的基因编辑工具难以应用，因为编码Cas9和效应蛋白的mRNA太大。
Cas9 RNPs是通过将纯化的Cas9与体外sgRNA和核糖核蛋白（RNPs）融合形成的复合物进入细胞后立即起作用。然而，RNP由于其复杂的组成和电荷特性而相对难以递送到细胞中，而蛋白质和核酸通常使用电穿孔与细胞穿透肽的辅助。随着递送载体的不断创新，科学家们已经确定外泌体是递送Cas9 RNP的一种有前途的方法。
04
CRISPR递送载体
将携带CRISPR/Cas9的质粒递送到特定细胞中需要载体，而载体需要满足以下特点才能在体内有效：（1）载体必须在血液中保持稳定，而不会降解或免疫清除，（2）载体随后在候选物组织中积累并触发细胞内吞作用，以及（3）CRISPR系统将溶酶体逃逸到细胞质中以执行基因组编辑或调节基因表达，特别是在递送的第二阶段，其中靶组织中的富集对于成功递送至关重要。
CRISPR递送载体主要包括以下几种：
4.1.病毒载体
在以前的研究中，病毒载体通常用于递送基因药物。CRISPR/Cas病毒载体系统制作过程如图7所示，依次是靶基因分析、sgRNA位点设计与筛选、载体构建、转染目标细胞系、qPCR方法检测载体活性和病毒包装。
图7. CRISPR/Cas病毒载体系统制作过程
在CRISPR-Cas9系统中常用的病毒载体包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒和杆状病毒载体。
AAV是最常用的病毒载体之一，因为它很容易越过物种屏障感染细胞，并且免疫原性非常低，因此不太可能引发炎症反应。
然而，与普通基因药物相比，CRISPR/Cas9基因编辑系统非常大，比AAV载体的最大包装容量高出4.7kb。特别是，当Cas9携带效应蛋白时，需要特殊的修改才能在AAV载体中加载，例如使用较小的SaCas9或将递送系统分成两个载体。
将较小的Cas9直系同源物SaCas9的编码序列整合到调节盒中，可以将效应子编码序列作为表观遗传调节因子，以促进Cas9调节活性，同时将质粒大小保持在AAV的承载能力范围内。
慢病毒是感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒，因此也经常用作递送载体。由于慢病毒的10kb负载能力，整个CRISPR/Cas9系统都可以加载到其中，但是因为慢病毒随机整合到宿主基因组中，它们经常引发一些免疫反应，甚至导致癌症。
杆状病毒是一种非致病性昆虫病毒，具有超大负载能力（~38KB），也被用于CRISPR/Cas9递送载体。
4.2.基于脂质的纳米载体
1987年，Felgner等人首次使用阳离子脂质体进行DNA转染。发现了使用脂质体进行基因传递的能力。在接下来的几十年中，脂质体经常被用作基因药物递送的载体，基于脂质体的纳米颗粒（LNP）被认为是CRISPR / Cas9转移的有前途的工具。
与脂质体不同，LNPs没有连续的脂质双层和较大的内水池，它们主要由天然磷脂、胆固醇和聚乙二醇等脂质组成。
血管生成素样3（Angptl3）是一种调节血浆脂蛋白水平。Angptl3功能的丧失会降低血液中甘油三酯（TGs）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，而不会引起任何临床风险。
Qiu等人开发了一种携带Cas9信使RNA（mRNA）的脂质纳米颗粒递送平台并指导RNA在体内对Angptl3进行基于CRISPR-Cas9的基因组编辑。该系统介导特异性和高效的Angptl3基因在野生型C57BL / 6小鼠的肝脏中敲低，导致血清ANGPTL3蛋白，低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平显着降低（图8）[4]。
图8. LNP介导的体内基于CRISPR-Cas9的基因组编辑诱导Angptl3功能丧失突变以降低血液血脂水平的示意图
4.3.基于聚合物的纳米颗粒
聚合物纳米颗粒具有免疫原性低、生物相容性好、高修饰性潜力。PLGA、壳聚糖和其他通常用于构建聚合物纳米颗粒壳的分子提高了细胞对聚合物的吸收效率。核心的PEI通常用作质粒转染试剂，由细胞内吞并触发质子海绵效应进入细胞质。此外，识别细胞膜表面受体的多肽和在特定pH、ATP和过氧化氢水平下通过分解代谢释放的聚合物被设计用于聚合物基纳米颗粒壳。
Liu等人描述了一种多级递送纳米颗粒（MDNP），可以实现CRISPR/dCas9系统的肿瘤靶向递送，并恢复体内内源性microRNA（miRNA）表达。MDNP被设计为核壳结构，其中壳由响应聚合物制成，赋予MDNP响应其周围微环境呈现不同表面特性的能力，使MNDP能够克服多种生理障碍，并以最佳效率向肿瘤组织提供递送（图9）。
MDNP/dCas9-miR-524对荷瘤小鼠的系统给药实现了肿瘤中miR-524的有效上调，导致与癌细胞增殖相关的多个信号通路同时受到干扰，并呈现出显着的肿瘤生长迟缓，表明利用MDNP的可行性可以使 CRISPR/dCas9的肿瘤靶向递送达到治疗效果 [5]。
图9. MDNP的制备和静脉注射后给药过程示意图
4.4.天然和功能化外泌体
外泌体是直径为30-100nm的膜结合囊泡，起源于细胞器中的多泡体（MVB）。在生物体中，外泌体用作蛋白质、脂质、核酸和其他细胞内因子的细胞间转移的培养基，几乎携带任何生物成分，包括质粒，副作用最小。
由于外泌体还直接包装sgRNA和Cas9，从而有效降低了运输过程中的脱靶副作用，它们构成了CRISPR / dCas9系统递送的有前途的载体。
Li等人通过构建融合蛋白来设计用于RNA加载的外泌体，其中外泌体膜蛋白CD9与RNA结合蛋白融合，而感兴趣的RNA要么天然携带，要么被设计为具有结合的元件。
Li等人将CD9与HuR融合，HuR是一种RNA结合蛋白与miR-155相互作用，具有相对较高的亲和力。在外泌体包装细胞中，当miR-155过度表达时，融合的CD9-HuR成功地将miR-155富集到外泌体中。此外，包封在外泌体中的miR-155反过来可以有效地递送到受体细胞中并识别内源性目标。
此外，Li等人还发现CD9-HuR外泌体可以富集功能性miRNA抑制剂或CRISPR / dCas9，当RNA被设计为具有富含AU的元素时（图10）[6]。
图10. 外泌体介导的CRISPR / dCas9系统递送
外泌体是内源性递送载体。由于它们与细胞膜的组成相似性，它们受到的阻碍较小，因此与病毒载体、脂质纳米载体和多态纳米载体相比，在递送过程中不太可能被免疫系统清除。
4.5.金纳米颗粒输送系统
金纳米颗粒可以是尺寸定制，不同尺寸具有不同的物理化学性质。最典型的特征之一是Au纳米粒子（AuNPs）的表面电子以由NP的大小决定的频率共振，这是一种在科学界被称为表面等离子体共振现象。
此外，金纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性，并且易于添加表面修饰，使其成为递送基因药物的理想载体。
例如，在治疗肿瘤等疾病时，AuNPs的表面可以用特定的癌细胞配体进行修饰，以增强它们对癌组织的识别。此外，金纳米颗粒本身具有抗炎抗菌特性，有利于治疗肿瘤。
Wang等人报道了一种通过多功能载体递送Cas9-sgPlk-1质粒（CP）进行肿瘤治疗的策略。他们通过静电相互作用将CPs缩合在TAT肽修饰的金纳米颗粒（AuNPs/CP，ACP）上，并在ACP上包被脂质（DOTAP、DOPE、胆固醇、PEG2000-DSPE），形成脂质包封的AuNPs缩合CP（LACP）（图11）。
LACP可以进入肿瘤细胞，并通过AuNPs的激光触发热效应将CP释放到细胞质中；CP可以通过TAT引导进入细胞核，从而能够有效敲除肿瘤（黑色素瘤）的靶基因（Plk-1），并在体外和体内抑制肿瘤。这种AuNPs缩合、脂质包封和激光控制的递送系统为高效CRISPR/Cas9递送和靶向基因编辑提供了一种通用方法，用于治疗多种疾病 [7]。
图11. LACP的合成过程
4.6.仿生纳米材料
纳米材料在循环中的稳定存在及其在体内特定部位进行富集积累的能力可以增强CRISPR基因编辑药物的治疗效果。然而，精心设计的有机或无机载体不可避免地被体内免疫系统部分清除。研究人员对使用生物体本身的材料表示了广泛的兴趣，这种生物膜可作为细胞包膜内容的“口袋”，以防止免疫系统识别。
当疾病发生时，免疫细胞通常是触发进入疾病部位并发挥抗炎作用。纳米材料封装在这些细胞的细胞膜中不仅会阻止可能的免疫清除，而且还增强了疾病部位基因药物的富集。
Yan等人报告了一种CRISPR-Cas9前药纳米系统（称为NanoProCas9），它结合了CRISPR-Cas9的靶向递送和条件激活，用于炎症性肠病的精准治疗。
NanoProCas9由（i）阳离子聚（b-氨基酯）（PBAE）组成，含有能够编码不稳定Cas9（dsCas9）核酸酶的质粒DNA，（ii）涂覆在PBAE/质粒纳米复合物上的一层仿生细胞膜，用于靶向递送PBAE / dsCas9复合物，以及（iii）锚定在面膜上的刺激响应前体分子。
NanoProCas9的系统给药能够将dsCas9质粒靶向递送到炎症病变中，其中前体小分子可以被ROS信号激活以稳定表达的dsCas9，从而激活Cas9功能以进行炎症基因组编辑。提出的“基因组编辑前药”提供了一个概念验证的例子，通过体内特定的病理刺激精确调节CRISPR/Cas9的功能。
首先设计用DHFR结构域编码dsCas9序列的质粒，然后与PBAE络合形成PBAE/质粒复合物。随后，通过挤出将聚合物涂覆自RAW264.7细胞的巨噬细胞膜（MM），以获得膜包被的多聚体（PPMM）。最后，将dsCas9的小分子稳定剂（TMP）通过硫酮接头与OE-PEG共价偶联，得到ROS响应的BAM-TK-TMP，并进一步锚定在PPMM膜上得到PPMMT。
PPMMT可以凭借MMs优选地靶向炎症结肠，其上可以释放锚定的TMP，伴随着炎症环境中介导的硫酮接头的切割。因此，PPMMT递送的质粒可以翻译成dsCas9并稳定在释放的TMP上以恢复基因组编辑活性。然而，翻译的dsCas9在非炎症组织中受到泛素依赖性蛋白酶体降解，从而最大限度地减少了组织水平上的脱靶基因组编辑，尽管PPMM呈非特异性分布（图12）[8]。
图12. NanoProCas9系统介导的靶向递送和炎症特异性基因组编辑示意图
05
CRISPR / Cas9在疾病中的应用
许多疾病伴随着体内基因表达，特别是一些由单个基因突变引起的遗传疾病，基因编辑技术有望在遗传水平上控制疾病的发生, 如癌症、肝脏疾病和心血管疾病等。
5.1.癌症
癌症发展的过程通常伴随着大量基因的异常表达，如P53、Notch和PD-L1。此外，发生肿瘤发生的微环境也表现出一些异常变化。
这些特征用于构建在特定环境中释放的纳米颗粒，并有效地将基因药物递送到肿瘤细胞。在肿瘤细胞中，异常表达的基因可能使用CRISPR技术被沉默或过度表达（图6b）。
Li等人构建了一种基于金纳米棒的缺氧响应纳米颗粒，该纳米颗粒携带CRISPR / Cas9系统将靶标HSP90α进行敲低。
5.2.肝脏疾病
肝脏是体内代谢脂质的主要器官，脂质体和脂质纳米颗粒没有特殊修饰更有可能在肝脏中富集。此外，肝脏中的许多细胞分泌大量外泌体的数量，这些具有同源组织靶向能力的肝细胞衍生外泌体将更容易富含肝脏。
与合成脂质纳米颗粒相比，这些天然存在的外泌体最初是蛋白质、核酸和其他分子细胞间递送的载体。因此，天然外泌体非常安全，很少被免疫系统清除。
Luo等人通过外泌体介导的CRISPR/dCas9-VP64活体进行肝星状细胞（HSCs）重编程。HSCs在肝纤维化的进展中起着至关重要的作用，可以将其视为抗纤维化治疗的特异性治疗靶点。靶向诱导造血干细胞
肝细胞通过CRISPR/dCas9系统递送肝细胞有望治疗肝纤维化。Luo等人报道将包封在AML12细胞来源外泌体中的CRISPR / dCas9-VP64系统可以有效地递送到HSC中靶向抗肝细胞核因子4a（HNF4a），成为肝纤维化的基因治疗策略（图13）[9]。
图13. CRISPR / dCas9-VP64系统靶向HNF4a
5.3.心血管疾病
心血管疾病是人类死亡的主要原因之一。常见的心血管疾病包括动脉粥样硬化、心肌肥大、心脏病发作和主动脉夹层。然而，与肿瘤和肝脏疾病不同，心脏和血管中的血流更快，血压更高，这对病变部位的纳米颗粒富集提出了挑战。
Zhang等人报道，具有丰富的羟基的CHO-PGEA可以提供基于pCas9-sgFbn1系统的质粒，用于敲除Fbn1基因中的外显子10。这是首次报道在成年小鼠主动脉基因编辑的多阳离子介导的CRISPR/Cas9系统。
CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1纳米系统可以有效有助于体外血管平滑肌细胞Fbn1中外显子10的敲除，导致Smad2/3磷酸化的变化和Fbn1两个下游信号Mmp-2和CTGF的表达增加。
对于体内应用，CHO-PGEA/Cas9-sgFbn1的主动脉富集是通过施用加压剂量的血管紧张素II（AngII）来实现的。靶向Fbn1的pCas9-sgFbn1系统的作用表明主动脉中Mmp-2和Ctgf的表达增加。因此，CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1的组合带有Ang II输注的纳米系统可以提供体内主动脉中的基因编辑（图14）[10]。
图14 .CHO-PGEA/pCas9纳米颗粒和血管紧张素II（Ang II）辅助体内递送的示意图
06
CRISPR/Cas9的挑战
CRISPR/Cas9技术有很多优势，如效率高、周期短、广谱性、多重编辑能力和功能丰富等，但是该技术在应用时也面临很多挑战，具体如下：
6.1.脱靶效应
CRISPR/Cas9被开发用于切割目标基因组位点，但它可能会切割其他位点并导致脱靶突变。通常，脱靶突变发生在看起来与靶位点相似的区域。
提高sgRNA的特异性，并在发生错配时将它们从DNA链中分离出来是解决这个问题的关键。Cas9的REC3结构域对于感测PAM远端出现的不匹配至关重要，研究人员已经对REC3结构域进行了突变，以检测哪些变体可能会提高Cas9的准确性。
6.2.有效性
当携带激活或抑制结构域的CRISPR/dCas9用于调节基因表达时，基因的上调或敲低可能不足以达到治疗效果。
一般来说，在进行基因编辑时，只设计一个sgRNA靶向靶位点的。Maeder等在靶基因转录起始位点附近的四个位置设计了sgRNA，以获得更高的基因激活效率。多个sgRNA的转录活化效率发挥了一定的协同作用，当sgRNA存在较多时，效率越高。此外，sgRNA在每个位置的转录激活效率并不相同，但与细胞和基因密切相关。
6.3.适用性
理论上，CRISPR/Cas9可以靶向基因组中的任何位置，但仅限于PAM序列，这阻止了Cas9到达某些位置。特别是，当使用碱基编辑工具 CBE 或 ABE，编辑后的碱基位于 PAM 位点的特定相对位置，如果没有合适的 PAM 站点CBE 或 ABE 可能无法执行碱基更改功能。
研究人员一直致力于修改Cas9，以确保它不仅限于PAM，并且他们已经获得了Cas9的多种变体，这些变体不限于通过突变Cas9位点或添加修饰的结构来识别NNG域。
6.4.安全性
基于CRISPR的基因编辑技术的安全性是研究人员关注的一个关键话题。Cas9对双链DNA的切割通常会触发NHEJ修复，而这些修复的DNA链通常缺少几个碱基对或者有几个添加的碱基对，这是预期的结果。然而，在验证编辑效率时，研究人员发现大量的碱基缺失和染色体结构有时会发生易位。这些错误可能会导致恶性肿瘤等位置性疾病，在临床应用中显然是不可接受的，尽管它们发生的可能性很低。
除此之外，载体的生物相容性也很重要。必须为候选细胞构建合适的载体，
从进入到实现功能的复杂过程要求载体必须具有生物相容性，具有高包封能力，并且能够穿越细胞膜，以减少脱靶CRISPR / Cas9系统引起不良反应的可能性。
在设计系统时也必须考虑将物质输送到体内产生的免疫反应。据报道，来自化脓链球菌和金黄色葡萄球菌的常用Cas9蛋白可引发人类的免疫反应。
作为克服这一挑战的方法，通过AAV递送修饰的Cas9缺乏反应引起外显子，以有效避免幼年和成年小鼠的体液和细胞免疫反应。
此外，即使是修饰的Cas9也必须在旨在避免触发宿主免疫反应的载体中运输。在体内，病毒、脂质和外泌体可有效避免免疫清除，而合成化学纳米颗粒需要在表面涂上保护涂层，例如改性PEG，它还可以稳定血液环境中的聚合物，或包含修饰的CD47蛋白。
6.5.靶向递送的难度
病毒和非病毒载体通常通过全身给药递送给动物，并且载体使CRISPR基因药物对血液和组织降解免疫。然而，未修饰的载体容易被体内代谢器官捕获。
CRISPR/Cas系统在进入非靶细胞时不会失去活性，而是对健康细胞进行基因修饰，这可能导致不可预测的后果。改进递送载体对于减少基因药物进入非靶细胞是必要的。
写在最后
CRISPR-Cas9作为新一代的基因编辑技术，在基因功能研究、模式动物构建、疾病基因治疗等方面具有广阔的应用前景。
CRISPR-Cas9生物形式一般有质粒DNA（pDNA），RNA或Cas9核糖核蛋白（RNP）三种不同形式，其中pDNA CRISPR/Cas9系统是最常用一种形式。
CRISPR-Cas9技术越来越成熟，在载体方面也有很大的进步，具有效率高、周期短、广谱性、多重编辑能力和功能丰富等优点，但也存在脱靶效应、有效性、适用性、安全性和靶向递送的难度等挑战。
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